«Probable acetyltransferase» TTHA1209 бактерии Thermus thermophilus: клонирование гена, структурный и функциональный анализ фермента
Аннотация
Обоснование. За последнюю декаду N-ацетилтрансферазы (AT) бактерий стали объектами интенсивного изучения, поскольку участвуют в биосинтезе/инактивации антибиотиков; образуют систему «токсин-антитоксин»; а статус ацетилирования белков и пептидов оказывает влияние на их вирулентность и патогенность. Ферменты AT обладают низким процентом идентичности аминокислотных последовательностей, что затрудняет их идентификацию и аннотацию в геномах. В этой связи цель данной работы заключалась в структурном и функциональном анализе новой «предполагаемой» ацетилтрансферазы («probable acetyltransferase»), кодируемой открытой рамкой считывания (ОРС) TTHA1209 бактерии T. thermophilus.
Материалы и методы. Структурный анализ фермента проводили методами биоинформатики. Для клонирования ОРС ТTHA1209 использовали методы генной инженерии. Для очистки белка применяли аффинную хроматографию. Проверку активности белка проводили в реакции in vitro ацетилирования модельного белка парвальбумина (ПА). Оценку включения ацетильной группы на N-конец парвальбумина проводили при помощи масс-спектрометрии.
Результаты. Установлено, что TTHA1209 содержит в своей структуре единственный GNAT-домен и обладает характерным для N-концевых AT (NAT) чередованием элементов вторичных структур и трёхмерной укладкой. Исследовано сходство структуры фермента TTHA1209 с белками-ортологами из E.coli. Наибольший процент идентичности TTHA1209 наблюдается с ферментом RimI (27%). Показано, что фермент TTHA1209 ацетилирует парвальбумин, т.е. проявляет специфическую Nα-ацетилтрансферазную активность.
Заключение. Новый фермент TTHA1209 бактерии T. thermophilus на всех уровнях организации проявляет свойства, характерные для NAT, обладает специфической активностью, и может быть аннотирован в геноме как N-концевая ацетилтрансфераза. Полученные результаты создают предпосылки для дальнейшего исследования субстратной специфичности и биохимических свойств новой NAT TTHA1209, что откроет перспективы его использования в биотехнологии для ацетилирования белков и пептидов.
Информация о спонсорстве. Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда, грант № 23-24-00478, https://rscf.ru/project/23-24-00478/.
EDN: PJYJXI
Скачивания
Литература
Bernal-Perez, L. F., & Ryu, Y. (2015). RimJ-Catalyzed Sequence-Specific Protein N-Terminal Acetylation in Escherichia coli. Advances in Bioscience and Biotechnology, 6, 12. https://doi.org/10.4236/abb.2015.63018
Bernal-Perez, L. F., Sahyouni, F., Prokai, L., & Ryu, Y. (2012). RimJ-mediated context-dependent N-terminal acetylation of the recombinant Z-domain protein in Escherichia coli. Mol Biosyst, 8, 1128-1130. https://doi.org/10.1039/c2mb05499j
Bienvenut, W. V., Giglione, C., & Meinnel, T. (2015). Proteome-wide analysis of the amino terminal status of Escherichia coli proteins at the steady-state and upon deformylation inhibition. Proteomics, 15, 2503-2518. https://doi.org/10.1002/pmic.201500027
Burckhardt, R. M., & Escalante-Semerena, J. C. (2020). Small-Molecule Acetylation by GCN5-Related N-Acetyltransferases in Bacteria. Microbiol Mol Biol Rev, 84. https://doi.org/10.1128/MMBR.00090-19 EDN: https://elibrary.ru/ATYYYZ
Chen, W., Biswas, T., Porter, V. R., Tsodikov, O. V., & Garneau-Tsodikova, S. (2011). Unusual regioversatility of acetyltransferase Eis, a cause of drug resistance in XDR-TB. Proc Natl Acad Sci U S A, 108, 9804-9808. https://doi.org/10.1073/pnas.1105379108
Christensen, D. G., Meyer, J. G., Baumgartner, J. T., D’Souza, A. K., Nelson, W. C., Payne, S. H., Kuhn, M. L., Schilling, B., & Wolfe, A. J. (2018). Identification of Novel Protein Lysine Acetyltransferases in Escherichia coli. mBio, 9. https://doi.org/10.1128/mBio.01905-18
Collars, O. A., Jones, B. S., Hu, D. D., Weaver, S. D., Sherman, T. A., Champion, M. M., & Champion, P. A. (2023). An N-acetyltransferase required for ESAT-6 N-terminal acetylation and virulence in Mycobacterium marinum. mBio, 14, e0098723. https://doi.org/10.1128/mbio.00987-23 EDN: https://elibrary.ru/TZOYBZ
D’Accolti, M., Bellotti, D., Dzien, E., Leonetti, C., Leveraro, S., Albanese, V., Marzola, E., Guerrini, R., Caselli, E., Rowinska-Zyrek, M., & Remelli, M. (2023). Impact of C- and N-terminal protection on the stability, metal chelation and antimicrobial properties of calcitermin. Sci Rep, 13, 18228. https://doi.org/10.1038/s41598-023-45437-0 EDN: https://elibrary.ru/MTBIVO
Dash, A., & Modak, R. (2021). Protein Acetyltransferases Mediate Bacterial Adaptation to a Diverse Environment. J Bacteriol, 203, e0023121. https://doi.org/10.1128/JB.00231-21 EDN: https://elibrary.ru/DSNGDE
Deng, S., & Marmorstein, R. (2021). Protein N-Terminal Acetylation: Structural Basis, Mechanism, Versatility, and Regulation. Trends Biochem Sci, 46, 15-27. https://doi.org/10.1016/j.tibs.2020.08.005 EDN: https://elibrary.ru/HVAAQD
Esipov, R. S., Makarov, D. A., Stepanenko, V. N., & Miroshnikov, A. I. (2016). Development of the intein-mediated method for production of recombinant thymosin beta4 from the acetylated in vivo fusion protein. J Biotechnol, 228, 73-81. https://doi.org/10.1016/j.jbiotec.2016.02.021 EDN: https://elibrary.ru/WWJBLJ
Favrot, L., Blanchard, J. S., & Vergnolle, O. (2016). Bacterial GCN5-Related N-Acetyltransferases: From Resistance to Regulation. Biochemistry, 23, 989-1002. https://doi.org/10.1021/acs.biochem.5b01269 EDN: https://elibrary.ru/WVMSQP
Huang, E., & Yousef, A. E. (2015). Biosynthesis of paenibacillin, a lantibiotic with N-terminal acetylation, by Paenibacillus polymyxa. Microbiol Res, 181, 15-21. https://doi.org/10.1016/j.micres.2015.08.001 EDN: https://elibrary.ru/YECKUW
Isono, K., & Isono, S. (1980). Ribosomal protein modification in Escherichia coli. II. Studies of a mutant lacking the N-terminal acetylation of protein S18. Mol. Gen. Genet, 177, 645-651. https://doi.org/10.1007/bf00272675 EDN: https://elibrary.ru/IFVGVY
Kazakov, T., Kuznedelov, K., Semenova, E., Mukhamedyarov, D., Datsenko, K. A., Metlitskaya, A., Vondenhoff, G. H., Tikhonov, A., Agarwal, V., Nair, S., Van Aerschot, A., & Severinov, K. (2014). The RimL transacetylase provides resistance to translation inhibitor microcin C. J Bacteriology, 196, 3377-3385. https://doi.org/10.1128/JB.01584-14 EDN: https://elibrary.ru/UEYGQT
Kudryashov, T. A., Trunilina, M. V., Bykov, V. V., Boldaevsky, I. S., Sokolov, A. S., & Lapteva, Y. S. (2023). Development of an algorithm for N-terminal acetyltransferases identification and verification of their functional activity. JOURNAL BIOMED, 19, 43-46. https://doi.org/10.33647/2713-0428-19-3 EDN: https://elibrary.ru/BJNZTF
Lapteva, Y. S., Vologzhannikova, A. A., Sokolov, A. S., Ismailov, R. G., Uversky, V. N., & Permyakov, S. E. (2021). In Vitro N-Terminal Acetylation of Bacterially Expressed Parvalbumins by N-Terminal Acetyltransferases from Escherichia coli. Appl Biochem Biotechnol. https://doi.org/10.1007/s12010-020-03324-8 EDN: https://elibrary.ru/CZOUMS
Le, V. T. B., Tsimbalyuk, S., Lim, E. Q., Solis, A., Gawat, D., Boeck, P., Lim, E. Q., Renolo, R., Forwood, J. K., & Kuhn, M. L. (2021). The Vibrio cholerae SpeG Spermidine/Spermine N-Acetyltransferase Allosteric Loop and beta6-beta7 Structural Elements Are Critical for Kinetic Activity. Front Mol Biosci, 8, 645768. https://doi.org/10.3389/fmolb.2021.645768 EDN: https://elibrary.ru/HFGLJF
Lee, K., & Back, K. (2023). Escherichia coli RimI Encodes Serotonin N-Acetyltransferase Activity and Its Overexpression Leads to Enhanced Growth and Melatonin Biosynthesis. Biomolecules, 13, 908. https://doi.org/10.3390/biom13060908 EDN: https://elibrary.ru/KUBTTZ
Li, D., Yang, Y., Li, R., Huang, L., Wang, Z., Deng, Q., & Dong, S. (2021). N-terminal acetylation of antimicrobial peptide L163 improves its stability against protease degradation. J Pept Sci, 27, e3337. https://doi.org/10.1002/psc.3337 EDN: https://elibrary.ru/HPPSFL
Miao, L., Fang, H., Li, Y., & Chen, H. (2007). Studies of the in vitro Nalpha-acetyltransferase activities of E. coli RimL protein. Biochem Biophys Res Commun, 357, 641-647. https://doi.org/10.1016/j.bbrc.2007.03.171
Miasaki, K. M. F., Wilke, N., Neto, J. R., & Alvares, D. S. (2020). N-terminal acetylation of a mastoparan-like peptide enhances PE/PG segregation in model membranes. Chem Phys Lipids, 232, 104975. https://doi.org/10.1016/j.chemphyslip.2020.104975 EDN: https://elibrary.ru/TSXNWP
Nesterchuk, M. V., Sergiev, P. V., & Dontsova, O. A. (2011). Posttranslational Modifications of Ribosomal Proteins in Escherichia coli. Acta Naturae, 3, 22-33. https://doi.org/10.32607/20758251-2011-3-2-22-33 EDN: https://elibrary.ru/OXKWAZ
Pace, C. N., Vajdos, F., Fee, L., Grimsley, G., & Gray, T. (1995). How to measure and predict the molar absorption coefficient of a protein. Protein Sci., 4, 2411-2423. https://doi.org/10.1002/pro.5560041120 EDN: https://elibrary.ru/XZNIPR
Pal, M., Yadav, V. K., Pal, P., Agarwal, N., & Rao, A. (2023). The physiological effect of rimI/rimJ silencing by CRISPR interference in Mycobacterium smegmatis mc(2)155. Arch Microbiol, 205, 211. https://doi.org/10.1007/s00203-023-03561-5 EDN: https://elibrary.ru/WNBFRF
Pathak, D., Bhat, A. H., Sapehia, V., Rai, J., & Rao, A. (2016). Biochemical evidence for relaxed substrate specificity of Na-acetyltransferase (Rv3420c/rimI) of Mycobacterium tuberculosis. Scientific reports, 6, 12.
Peri, S., Steen, H., & Pandey, A. (2001). GPMAW-a software tool for analyzing proteins and peptides. Trends Biochem Sci, 26, 687-689. https://doi.org/10.1016/s0968-0004(01)01954-5 EDN: https://elibrary.ru/AQGWYS
Permyakov, S. E., Vologzhannikova, A. A., Emelyanenko, V. I., Knyazeva, E. L., Kazakov, A. S., Lapteva, Y. S., Permyakova, M. E., Zhadan, A. P., & Permyakov, E. A. (2012). The impact of alpha-N-acetylation on structural and functional status of parvalbumin. Cell Calcium, 52, 366-376. https://doi.org/10.1016/j.ceca.2012.06.002 EDN: https://elibrary.ru/SOHVBX
Pletnev, P. I., Shulenina, O., Evfratov, S., Treshin, V., Subach, M. F., Serebryakova, M. V., Osterman, I. A., Paleskava, A., Bogdanov, A. A., Dontsova, O. A., Konevega, A. L., & Sergiev, P. V. (2022). Ribosomal protein S18 acetyltransferase RimI is responsible for the acetylation of elongation factor Tu. J Biol Chem, 298, 101914. https://doi.org/10.1016/j.jbc.2022.101914 EDN: https://elibrary.ru/PJSPCV
Ren, Y., Yao, X., Dai, H., Li, S., Fang, H., Chen, H., & Zhou, C. (2011). Production of Na-acetylated thymosin a1 in Escherichia coli. Microbial Cell Factories, 10, 2-8. https://doi.org/10.1186/1475-2859-10-26 EDN: https://elibrary.ru/ONECBZ
Roy-Chaudhuri, B., Kirthi, N., Kelley, T., & Culver, G. M. (2008). Suppression of a cold-sensitive mutation in ribosomal protein S5 reveals a role for RimJ in ribosome biogenesis. Mol Microbiol, 68, 1547-1559. https://doi.org/10.1111/j.1365-2958.2008.06252.x
Schmidt, A., Kochanowski, K., Vedelaar, S., Ahrne, E., Volkmer, B., Callipo, L., Knoops, K., Bauer, M., Aebersold, R., & Heinemann, M. (2016). The quantitative and condition-dependent Escherichia coli proteome. Nat Biotechnol, 34, 104-110. https://doi.org/10.1038/nbt.3418 EDN: https://elibrary.ru/BUYYEB
Vetting, M. W., Bareich, D. C., Yu, M., & Blanchard, J. S. (2008). Crystal structure of RimI from Salmonella typhimurium LT2, the GNAT responsible for N(alpha)-acetylation of ribosomal protein S18. Protein Sci, 17, 1781-1790. https://doi.org/10.1110/ps.035899.108
Vetting, M. W., Carvalho, L. P. S., Roderick, S. L., & Blanchard, J. S. (2005). A Novel Dimeric Structure of the RimL Nα-acetyltransferase from Salmonella typhimurium. J Biol Chem, 280, 22108-22114. https://doi.org/10.1074/jbc.M502401200 EDN: https://elibrary.ru/MINOZH
Vetting, M. W., Carvalho, L. P. S., Yu, M., Hegde, S. S., Magnet, S., Roderick, S. L., & Blanchard, J. S. (2005). Structure and functions of the GNAT superfamily of acetyltransferases. Archives of Biochemistry and Biophysics, 433, 212-226. https://doi.org/10.1016/j.abb.2004.09.003
White-Ziegler, C. A., Black, A. M., Eliades, S. H., Young, S., & Porter, K. (2002). The N-acetyltransferase RimJ responds to environmental stimuli to repress pap fimbrial transcription in Escherichia coli. J Bacteriol, 184, 4334-4342. https://doi.org/10.1128/JB.184.16.4334-4342.2002
White-Ziegler, C. A., & Low, D. A. (1992). Thermoregulation of the pap operon: evidence for the involvement of RimJ, the N-terminal acetylase of ribosomal protein S5. J Bacteriol, 174, 7003-7012. https://doi.org/10.1128/jb.174.21.7003-7012.1992
Yoshikawa, A., Isono, S., Sheback, A., & Isono, K. (1987). Cloning and nucleotide sequencing of the genes rimI and rimJ which encode enzymes acetylating ribosomal proteins S18 and S5 of Escherichia coli K12. Mol. Gen. Genet., 209, 481-488. https://doi.org/10.1007/BF00331153 EDN: https://elibrary.ru/SZGZVG
Copyright (c) 2025 Timofey A. Kudryashov, Eugene V. Loktyushov, Maria V. Trunilina, Vyacheslav V. Bykov, Andrey S. Sokolov, Yulia S. Lapteva
Это произведение доступно по лицензии Creative Commons «Attribution-NonCommercial-NoDerivatives» («Атрибуция — Некоммерческое использование — Без производных произведений») 4.0 Всемирная.
