Видовая идентификация бактерий рода Clostridium, выделенных от крупного рогатого скота, при помощи мультиплексной ПЦР в режиме реального времени
Аннотация
Обоснование. Болезни, вызываемые клостридиями, широко распространены у крупного рогатого скота. В организме животных помимо патогенных клостридий, постоянно обитают непатогенные виды и для постановки правильного диагноза необходимо дифференцировать выделенные культуры этих бактерий. Перспективным направлением для решения этой задачи является поиск высоко специфичных и чувствительных методов генетического анализа. Основанных на применении полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени, которые дают возможность в короткие сроки выявлять и определять видовую принадлежность микроорганизмов.
Цель. Разработать мультиплексную полимеразную цепную реакцию в реальном времени, позволяющую выявлять токсигенные виды клостридий: Clostridium sporogenes, Clostridium perfringens и Clostridium sordellii в смешанных и чистых бактериальных культурах, определить ее чувствительность и специфичность.
Материалы и методы. В своих исследованиях использовали пробы биологического материала от больных животных, из которых выделяли культуры клостридий на искусственных питательных средах с последующей их идентификацией по результатам изучения культуральных и биохимических свойств. Праймеры и зонды разрабатывали с использованием инструмента PrimerQuest, затем определяли чувствительность и специфичность ПЦР с использованием референтных штаммов и изолятов бактерий.
Результаты. В период с 2023 г. по 2024 г. исследовали 90 проб биоматериала от крупного рогатого скота, отобранных в животноводческих хозяйствах Новосибирской области. В результате бактериологических исследований было получено 44 изолята клостридий девяти видов рода Clostridium. Для осуществления подбора праймеров и зондов провели анализ, в результате которого выбрали три пары праймеров и зондов, которые использовали для обнаружения у C. sporogenes гена gerKA, C. perfringens – plc, C. sordelli – NanS. Кроме того в работе использовали пару праймеров для выявления видов рода Clostridium по гену 16S РНК. С целью определения рабочих концентраций праймеров и зондов, обеспечивающих необходимую чувствительность анализа, была проведена серия исследований, которые позволили оптимизировать условия его проведения. Анализируя результаты исследований, определили чувствительность реакции, которая составила для чистых культур бактерий видов C. sporogenes, C. perfringens и C. sordelli не менее 102 КОЕ/мл, а для других видов Clostridia spp. 101 КОЕ/мл.
Заключение. Разработанная мультиплексная ПЦР в реальном времени позволяет в короткие сроки проводить диагностику клостридиозов крупного рогатого скота и видовую идентификацию возбудителей. В этиологии клостридиозов крупного рогатого скота помимо C. perfringens, C. sporogenes, C. sordellii могут принимать участие и другие виды Clostridium spp. Необходимо совершенствовать методы диагностики клостридиозов и расширять спектр выявляемых видов клостридий.
Информация о спонсорстве. Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда по проекту 23-26-00009 «Видовой состав и токсигенные свойства клостридий у крупного рогатого скота в Западно-Сибирском регионе и разработка тест-системы для их быстрой идентификации».
EDN: PSCOZR
Скачивания
Литература
Батаева, Д. С., Махова, А. А., Зайко, Е. В., & Cатабаева, Д. М. (2020). Ускоренная диагностика клостридий в пищевых продуктах с использованием ПЦР в реальном времени. Все о мясе, 2, 50-53. https://doi.org/10.21323/2071-2499-2020-2-50-53. EDN: https://elibrary.ru/TRLXAC
Безбородова, Н. А. (2020). Современный подход к проблеме клостридиозов в животноводстве: отбор проб, лабораторная диагностика, профилактика. Российский журнал «Проблемы ветеринарной санитарии, гигиены и экологии», 3(35), 392-402. https://doi.org/10.36871/vet.san.hyg.ecol.202003016. EDN: https://elibrary.ru/JHUVAH
Глотова, Т. И., Судоргина, Т. И., Котенева, С. В., Глотов, А. Г., Велькер, Д. А., & Нефедченко, А. В. (2023). Патогенные виды анаэробных бактерий и их роль в патологии крупного рогатого скота. Успехи медицинской микологии, XXV, 14-19. EDN: https://elibrary.ru/NTPITW
Данилюк, А. В., & Капустин, А. В. (2019). Распространенность и видовое разнообразие клостридий — возбудителей анаэробных инфекций крупного рогатого скота. Труды всероссийского НИИ экспериментальной ветеринарии им. Я. Р. Коваленко, 81, 19-26. https://doi.org/10.30917/ATT-PRINT-2019-10(3)
Колесникова, Ю. Н., Пименов, Н. В., & Капустин, А. В. (2016). Этиология анаэробных инфекций крупного рогатого скота и сравнительная характеристика выделенных штаммов клостридий. Российский журнал сельскохозяйственных и социально-экономических наук, 8, 39-48. https://doi.org/10.18551/rjoas.2016-08.07. EDN: https://elibrary.ru/WIBLWP
Наумова, Н. Б., Батурина, О. А., Локтева, А. С., Плешакова, В. И., Лешева, Н. А., Лоренгель, Т. И., Золотова, Н. С., Алексеева, И. Г., & Кабилов, М. Р. (2023). Влияние декстраналя на бактериобиом кишечника телят. Siberian Journal of Life Sciences and Agriculture, 15(6), 197-221. https://doi.org/10.12731/2658-6649-2023-15-6-956. EDN: https://elibrary.ru/UVVYIJ
Нефедченко, А. В., Глотов, А. Г., Глотова, Т. И., Судоргина, Т. Е., & Котенева, С. В. (2023). Использование молекулярно-генетических методов для типирования клостридий видов C. sporogenes, C. perfringens и C. sordellii. В Сборник трудов XI Международной научно-практической конференции «Молекулярная диагностика» (с. 354-355). Москва. EDN: https://elibrary.ru/DTRHTW
Судоргина, Т. Е., Глотова, Т. И., Нефедченко, А. В., Котенева, С. В., Велькер, Д. А., & Глотов, А. Г. (2024). Частота выделения бактерий Clostridium spp. и их ассоциаций при различных формах клостридиоза крупного рогатого скота. Сибирский вестник сельскохозяйственной науки, 54(3), 55-62. https://doi.org/10.26898/0370-8799-2024-3-6. EDN: https://elibrary.ru/ZZVDGV
Судоргина, Т. Е., Глотова, Т. И., Котенева, С. В., Нефедченко, А. В., & Глотов, А. Г. (2023). Современные представления о возбудителях клостридиальной анаэробной инфекции крупного рогатого скота. В Актуальные проблемы инфекционной патологии животных и пути их решения: Материалы международной научно-практической конференции, посвященной Дню Белорусской науки и 95-летию кафедры эпизоотологии и инфекционных болезней (с. 109-111). Витебск. EDN: https://elibrary.ru/ELNBCW
Судоргина, Т. Е., Глотова, Т. И., Котенева, С. В., Нефедченко, А. В., Велькер, Д. А., & Глотов, А. Г. (2023). Клостридиозы крупного рогатого скота: характеристика основных возбудителей, меры профилактики и борьбы. Часть 1. Ветеринария, 5, 3-9. https://doi.org/10.30896/0042-4846.2023.26.5.03-09. EDN: https://elibrary.ru/QLUFXE
Сунцова, О. В., Рар, В. А., Лисак, О. В., Мельцов, И. В., Дорощенко, Е. К., Савинова, Ю. С., Тикунов, А. Ю., & Козлова, И. В. (2023). Эпизоотическая ситуация в отношении гемопаразитарных заболеваний сельскохозяйственных животных в Иркутской области. Siberian Journal of Life Sciences and Agriculture, 15(4), 210-235. https://doi.org/10.12731/2658-6649-2023-15-4-210-235. EDN: https://elibrary.ru/RFJMLR
Abreu, C. C., Edwards, E. E., Edwards, J. F., Gibbons, P. M., Leal de Araújo, J., Rech, R. R., & Uzal, F. A. (2017). Blackleg in cattle: A case report of fetal infection and a literature review. Journal of veterinary diagnostic investigation, 29(5), 612-621. https://doi.org/10.1177/1040638717713796
Abusnina, W., Shehata, M., Karem, E., Koc, Z., & Khalil, E. (2019). Clostridium sporogenes bacteremia in an immunocompetent patient. IDCases, 15, e00481. https://doi.org/10.1016/j.idcr.2019.e00481
Awad, M. M., Singleton, J., & Lyras, D. (2016). The Sialidase NanS Enhances Non-TcsL Mediated Cytotoxicity of Clostridium sordellii. Toxins (Basel), 8(6), 189. https://doi.org/10.3390/toxins8060189
Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology. Volume 3: The Firmicutes (2nd ed.). (2009). New York: Springer-Verlag. pp. 1309-1329. https://doi.org/10.1007/978-0-387-68489-5_2
Chean, R., Kotsanas, D., Francis, M. J., Palombo, E. A., Jadhav, S. R., Awad, M. M., Lyras, D., Korman, T. M., & Jenkin, G. A. (2014). Comparing the identification of Clostridium spp. by two Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight (MALDI-TOF) mass spectrometry platforms to 16S rRNA PCR sequencing as a reference standard: a detailed analysis of age of culture and sample preparation. Anaerobe, 30, 85-89. https://doi.org/10.1016/j.anaerobe.2014.09.007
Goossens, E., Valgaeren, B. R., Pardon, B., Haesebrouck, F., Ducatelle, R., Deprez, P. R., & Van Immerseel, F. (2017). Rethinking the role of alpha toxin in Clostridium perfringens-associated enteric diseases: a review on bovine necrohaemorrhagic enteritis. Veterinary research, 48(1), 9. https://doi.org/10.1186/s13567-017-0413-x. EDN: https://elibrary.ru/KMLWKY
Moore, R. J., & Lacey, J. A. (2019). Genomics of the Pathogenic Clostridia. Microbiol Spectr, 7(3). https://doi.org/10.1128/microbiolspec
Rodriguez-Palacios, A., Stämpfli, H. R., Duffield, T., Peregrine, A. S., Trotz-Williams, L. A., Arroyo, L. G., Brazier, J. S., & Weese, J. S. (2006). Clostridium difficile PCR ribotypes in calves, Canada. Emerg. Infect. Dis, 12(11), 1730-1736. https://doi.org/10.3201/eid1211.051581
Seise, B., Pollok, S., Seyboldt, C., & Weber, K. (2013). Dry-reagent-based PCR as a novel tool for the rapid detection of Clostridium spp. J. Med. Microbiol, 62(Pt 10), 1588-1591. https://doi.org/10.1099/jmm.0.060061-0
Silva, R. O. S., Uzal, F. A., Oliveira Jr, C. A., & Lobato, F. C. F. (2016). Clostridial Diseases of Animal. In John Wiley & Sons, Ltd. (pp. 243-254). Hoboken, NJ, USA. https://doi.org/10.1002/9781118728291.ch20
Morandi, S., Cremonesi, P., Silvetti, T., Castiglioni, B., & Brasca, M. (2015). Development of a triplex real-time PCR assay for the simultaneous detection of Clostridium beijerinckii, Clostridium sporogenes and Clostridium tyrobutyricum in milk. Anaerobe, 34, 44-49. https://doi.org/10.1016/j.anaerobe.2015.04.005
Uzal, A., & Songer, J. G. (2019). Clostridial Diseases (pp. 792-806). https://doi.org/10.1002/9781119350927.ch51
References
Bataeva, D. S., Makhova, A. A., Zayko, E. V., & Satabaeva, D. M. (2020). Rapid diagnosis of Clostridium in food products using real-time PCR. All About Meat, 2, 50-53. https://doi.org/10.21323/2071-2499-2020-2-50-53. EDN: https://elibrary.ru/TRLXAC
Bezbordova, N. A. (2020). Modern approach to the problem of clostridiosis in animal husbandry: sampling, laboratory diagnostics, prevention. Russian Journal "Problems of Veterinary Sanitation, Hygiene and Ecology", 3(35), 392-402. https://doi.org/10.36871/vet.san.hyg.ecol.202003016. EDN: https://elibrary.ru/JHUVAH
Glotova, T. I., Sudorgina, T. I., Koteneva, S. V., Glotov, A. G., Velker, D. A., & Nefedchenko, A. V. (2023). Pathogenic species of anaerobic bacteria and their role in the pathology of cattle. Advances in Medical Mycology, XXV, 14-19. EDN: https://elibrary.ru/NTPITW
Danilyuk, A. V., & Kapustin, A. V. (2019). Prevalence and species diversity of Clostridium — causative agents of anaerobic infections in cattle. Proceedings of the All-Russian Research Institute of Experimental Veterinary Medicine named after Ya. R. Kovalenko, 81, 19-26. https://doi.org/10.30917/ATT-PRINT-2019-10(3)
Kolesnikova, Yu. N., Pimenov, N. V., & Kapustin, A. V. (2016). Etiology of anaerobic infections in cattle and comparative characteristics of isolated Clostridium strains. Russian Journal of Agricultural and Socio-Economic Sciences, 8, 39-48. https://doi.org/10.18551/rjoas.2016-08.07. EDN: https://elibrary.ru/WIBLWP
Naumova, N.B., Baturina, O.A., Lokteva, A.S., Pleshakova, V.I., Lesheva, N.A., Lorengel, T.I., Zolotova, N.S., Alekseeva, I.G., & Kabilov, M.R. (2023). Effect of dextranol on calves' intestinal bacteriome. Siberian Journal of Life Sciences and Agriculture, 15(6), 197-221. https://doi.org/10.12731/2658-6649-2023-15-6-956. EDN: https://elibrary.ru/UVVYIJ
Nefedchenko, A. V., Glotov, A. G., Glotova, T. I., Sudorgina, T. E., & Koteneva, S. V. (2023). Use of molecular genetic methods for typing Clostridium species C. sporogenes, C. perfringens and C. sordellii. In Proceedings of the XI International Scientific and Practical Conference "Molecular Diagnostics" (pp. 354-355). Moscow. EDN: https://elibrary.ru/DTRHTW
Sudorgina, T. E., Glotova, T. I., Nefedchenko, A. V., Koteneva, S. V., Velker, D. A., & Glotov, A. G. (2024). Frequency of isolation of Clostridium spp. bacteria and their associations in various forms of clostridiosis in cattle. Siberian Herald of Agricultural Science, 54(3), 55-62. https://doi.org/10.26898/0370-8799-2024-3-6. EDN: https://elibrary.ru/ZZVDGV
Sudorgina, T. E., Glotova, T. I., Koteneva, S. V., Nefedchenko, A. V., & Glotov, A. G. (2023). Current views on the causative agents of clostridial anaerobic infection in cattle. In Actual problems of infectious pathology of animals and ways to solve them: Proceedings of the International Scientific and Practical Conference dedicated to the Day of Belarusian Science and the 95th anniversary of the Department of Epizootology and Infectious Diseases (pp. 109-111). Vitebsk. EDN: https://elibrary.ru/ELNBCW
Sudorgina, T. E., Glotova, T. I., Koteneva, S. V., Nefedchenko, A. V., Velker, D. A., & Glotov, A. G. (2023). Clostridiosis in cattle: characterization of the main causative agents, preventive measures and control. Part 1. Veterinary Medicine, 5, 3-9. https://doi.org/10.30896/0042-4846.2023.26.5.03-09. EDN: https://elibrary.ru/QLUFXE
Suntsova, O. V., Rar, V. A., Lisak, O. V., Meltsov, I. V., Doroshenko, E. K., Savinova, Yu. S., Tikunov, A. Yu., & Kozlova, I. V. (2023). Epidemiological situation regarding hemoparasitic diseases of farm animals in the Irkutsk region. Siberian Journal of Life Sciences and Agriculture, 15(4), 210-235. https://doi.org/10.12731/2658-6649-2023-15-4-210-235. EDN: https://elibrary.ru/RFJMLR
Abreu, C. C., Edwards, E. E., Edwards, J. F., Gibbons, P. M., Leal de Araújo, J., Rech, R. R., & Uzal, F. A. (2017). Blackleg in cattle: A case report of fetal infection and a literature review. Journal of veterinary diagnostic investigation, 29(5), 612-621. https://doi.org/10.1177/1040638717713796
Abusnina, W., Shehata, M., Karem, E., Koc, Z., & Khalil, E. (2019). Clostridium sporogenes bacteremia in an immunocompetent patient. IDCases, 15, e00481. https://doi.org/10.1016/j.idcr.2019.e00481
Awad, M. M., Singleton, J., & Lyras, D. (2016). The Sialidase NanS Enhances Non-TcsL Mediated Cytotoxicity of Clostridium sordellii. Toxins (Basel), 8(6), 189. https://doi.org/10.3390/toxins8060189
Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology. Volume 3: The Firmicutes (2nd ed.). (2009). New York: Springer-Verlag. pp. 1309-1329. https://doi.org/10.1007/978-0-387-68489-5_2
Chean, R., Kotsanas, D., Francis, M. J., Palombo, E. A., Jadhav, S. R., Awad, M. M., Lyras, D., Korman, T. M., & Jenkin, G. A. (2014). Comparing the identification of Clostridium spp. by two Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight (MALDI-TOF) mass spectrometry platforms to 16S rRNA PCR sequencing as a reference standard: a detailed analysis of age of culture and sample preparation. Anaerobe, 30, 85-89. https://doi.org/10.1016/j.anaerobe.2014.09.007
Goossens, E., Valgaeren, B. R., Pardon, B., Haesebrouck, F., Ducatelle, R., Deprez, P. R., & Van Immerseel, F. (2017). Rethinking the role of alpha toxin in Clostridium perfringens-associated enteric diseases: a review on bovine necrohaemorrhagic enteritis. Veterinary research, 48(1), 9. https://doi.org/10.1186/s13567-017-0413-x. EDN: https://elibrary.ru/KMLWKY
Moore, R. J., & Lacey, J. A. (2019). Genomics of the Pathogenic Clostridia. Microbiol Spectr, 7(3). https://doi.org/10.1128/microbiolspec
Rodriguez-Palacios, A., Stämpfli, H. R., Duffield, T., Peregrine, A. S., Trotz-Williams, L. A., Arroyo, L. G., Brazier, J. S., & Weese, J. S. (2006). Clostridium difficile PCR ribotypes in calves, Canada. Emerg. Infect. Dis, 12(11), 1730-1736. https://doi.org/10.3201/eid1211.051581
Seise, B., Pollok, S., Seyboldt, C., & Weber, K. (2013). Dry-reagent-based PCR as a novel tool for the rapid detection of Clostridium spp. J. Med. Microbiol, 62(Pt 10), 1588-1591. https://doi.org/10.1099/jmm.0.060061-0
Silva, R. O. S., Uzal, F. A., Oliveira Jr, C. A., & Lobato, F. C. F. (2016). Clostridial Diseases of Animal. In John Wiley & Sons, Ltd. (pp. 243-254). Hoboken, NJ, USA. https://doi.org/10.1002/9781118728291.ch20
Morandi, S., Cremonesi, P., Silvetti, T., Castiglioni, B., & Brasca, M. (2015). Development of a triplex real-time PCR assay for the simultaneous detection of Clostridium beijerinckii, Clostridium sporogenes and Clostridium tyrobutyricum in milk. Anaerobe, 34, 44-49. https://doi.org/10.1016/j.anaerobe.2015.04.005
Uzal, A., & Songer, J. G. (2019). Clostridial Diseases (pp. 792-806). https://doi.org/10.1002/9781119350927.ch51
Copyright (c) 2025 Alexey V. Nefedchenko, Tatiana E. Sudorgina, Tatiana I. Glotova, Svetlana V. Koteneva, Alexander G. Glotov
Это произведение доступно по лицензии Creative Commons «Attribution-NonCommercial-NoDerivatives» («Атрибуция — Некоммерческое использование — Без производных произведений») 4.0 Всемирная.
