АНАЛИЗ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ В КЛЕТКАХ СУСПЕНЗИОННОЙ КУЛЬТУРЫ ARABIDOPSIS THALIANA С ПОНИЖЕННОЙ ЭКСПРЕССИЕЙ ГЕНА NDB2

  • Irina V. Fedoseeva Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Сибирский институт физиологии и биохимии растений Сибирского отделения Российской академии наук (СИФИБР СО РАН) http://orcid.org/0000-0001-6529-9304
  • Alexander I. Katyshev Федеральное бюджетное учреждение науки Сибирский институт физиологии и биохимии растений Сибирского отделения Российской академии наук http://orcid.org/0000-0001-7856-0460
  • Anna V. Fedyaeva Федеральное бюджетное учреждение науки Сибирский институт физиологии и биохимии растений Сибирского отделения Российской академии наук
  • Alexey V. Stepanov Федеральное бюджетное учреждение науки Сибирский институт физиологии и биохимии растений Сибирского отделения Российской академии наук http://orcid.org/0000-0002-0456-3690
  • Gennadii B. Borovskii Федеральное бюджетное учреждение науки Сибирский институт физиологии и биохимии растений Сибирского отделения Российской академии наук http://orcid.org/0000-0002-5089-5311
Ключевые слова: Arabidopsis thaliana (экотип Columbia), NAD(Р)Н дегидрогеназы II типа, экспрессия генов

Аннотация

Обоснование. Альтернативный путь дыхания митохондрий растений не связан с синтезом АТФ и, следовательно, не контролируется непосредственно энергетическим статусом клетки. Альтернативный дыхательный путь включает в себя ротенон нечувствительные NAD(Р)Н дегидрогеназы II типа, расположенные как на внешней, так и на внутренней поверхности внутренней мембраны митохондрий, убихинон и альтернативную оксидазу (AOX). Предполагается, что альтернативные NAD(P)H дегидрогеназы имеют функции, сходные с функциями AOX, среди которых термогенез, предотвращение образования АФК, окисление избытка восстановителей для продолжения метаболических путей и др. Публикаций об успешном подавлении экспрессии NDB2 пока недостаточно. Например, показано, что растения арабидопсиса, лишенные и AOX1a и NDB2 были более чувствительны к комбинированной засухе и повышенному освещению, в то время как растения, гиперэкспрессирующие эти гены, демонстрировали повышенную устойчивость и способность к постстрессовому восстановлению.

Цель. Целью данной работы являлось изучить, как подавление экспрессии NDB2 в гетеротрофных клетках суспензионной культуры арабидопсиса повлияет на экспрессию других генов альтернативного пути дыхания, разобщающих белков, а также генов белков теплового шока в не стрессовых условиях.

Материалы и методы. Для выделения РНК отбирали по 5 мл клеток суспензионных культур. РНК выделяли с помощью реактивов из набора GeneJET Plant RNA Purification Mini Kit (Thermo Scientific, Литва), согласно инструкции производителя.

Синтез первой цепи кДНК осуществляли с использованием набора реактивов Thermo Scientific (Литва), согласно рекомендациям фирмы производителя.

ПЦР-РВ проводили на приборе CFX96™ Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad, США), используя набор реактивов qPCR mix-HS SYBR (Евроген, Россия), согласно инструкции производителя. Анализ данных ПЦР-РВ проводили с помощью программного обеспечения SFX Manager (Bio-Rad, Германия). Все эксперименты проводились в двух аналитических и трех биологических повторностях. В качестве референсного гена использовали ген, кодирующий глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназу – GAPD.

Результаты. Количество мРНК гена NDB2 в клетках суспензионной культуры линии AS5 было снижено в 8,2 раза по сравнению с контролем Col-0. Подавление экспрессии гена NDB2 в клетках суспензионной культуры арабидопсиса линии AS5 приводило к увеличению количества транскриптов не только гена NDB4, но и NDB1, а также NDA2 и NDC1; в то же время экспрессия генов NDB3 и NDA1 снижалась по сравнению с клетками Col-0. Мы не обнаружили изменения уровней экспрессии генов AOX1a, AOX1b и AOX1d в клетках линии AS5 по сравнению с контролем, однако количество транскриптов гена AOX1c несколько увеличивалось. При анализе уровней экспрессии генов, кодирующих разобщающие белки, было обнаружено увеличение экспрессии гена UCP1 в клетках линии AS5. В клетках суспензионной культуры линии AS5 повышались уровни экспрессии всех исследуемых нами генов БТШ, кроме HSP17.7.

Заключение. Таким образом, полученные результаты предполагают, что подавление экспрессии гена NDB2 в гетеротрофных клетках арабидопсиса в отсутствие стресса изменяет редокс-статус клетки, что, в свою очередь, приводит к изменениям уровней накопления транскриптов других генов NAD(Р)Н дегидрогеназ и увеличению экспрессии генов БТШ, при этом экспрессия ключевых генов AOX не изменяется.

Скачивания

Данные скачивания пока не доступны.

Биографии авторов

Irina V. Fedoseeva, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Сибирский институт физиологии и биохимии растений Сибирского отделения Российской академии наук (СИФИБР СО РАН)

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории физиологической генетики

Alexander I. Katyshev, Федеральное бюджетное учреждение науки Сибирский институт физиологии и биохимии растений Сибирского отделения Российской академии наук

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории физиологической генетики

Anna V. Fedyaeva, Федеральное бюджетное учреждение науки Сибирский институт физиологии и биохимии растений Сибирского отделения Российской академии наук

кандидат биологических наук, научный сотрудник лаборатории физиологической генетики

Alexey V. Stepanov, Федеральное бюджетное учреждение науки Сибирский институт физиологии и биохимии растений Сибирского отделения Российской академии наук

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории физиологической генетики

Gennadii B. Borovskii, Федеральное бюджетное учреждение науки Сибирский институт физиологии и биохимии растений Сибирского отделения Российской академии наук

доктор биологических наук, главный научный сотрудник лаборатории физиологической генетики

Литература

Rikhvanov E.G., Fedoseeva I.V., Pyatrikas D.V., Stepanov A.V., Borovskiy G.B., Voynikov V.K. Fiziologiya rasteniy, 2014, vol. 61, no. 2, pp. 155-169. https://doi.org/10.1134/S1021443714020125

Shishlova-Sokolovskaya A.M., Urbanovich O.Yu., Fedoseeva I.V., Bo-rovskiy G.B. Molekulyarnaya i prikladnaya genetika, 2017, vol. 22, pp. 76-83.

Amirsadeghi S., Robson C.A., Vanlerberghe G.C. The role of the mitochondrion in plant responses to biotic stress. Physiologia Plantarum, 2007, vol. 129, no. 1, pp. 253-266. https://doi.org/10.1111/j.1399-3054.2006.00775.x

Brand M.D. Mitochondrial generation of superoxide and hydrogen peroxide as the source of mitochondrial redox signaling. Free Radic. Biol. Med., 2016, vol. 100, pp. 14-31. https://doi.org/10.1016/j.freeradbiomed.2016.04.001

Clifton R., Millar A.H., Whelan J. Alternative oxidases in Arabidopsis: a comparative analysis of differential expression in the gene family provides new insights into function of non-phosphorylating bypasses. Biochimica et Biophysica Acta (BBA): Bioenergetics, 2006, vol. 1757, no. 7, pp. 730-741. https://doi.org/10.1016/j.bbabio.2006.03.009

Clough S.J., Bent A.F. Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. Plant J., 1998, vol. 16, no. 6, pp. 735-743. https://doi.org/10.1046/j.1365-313x.1998.00343.x

Considine M.J., Goodman M., Echtay K.S., Laloi M., Whelan J., Brand M.D., Sweetlove L.J. Superoxide stimulates a proton leak in potato mitochondria that is related to the activity of uncoupling protein. J. Biol. Chem., 2003, vol. 278, no. 25, pp. 22298-22302. https://doi.org/10.1074/jbc.M301075200

Czechowski T., Stitt M., Altmann T., Udvardi M.K., Scheible W.R. Genome-wide identification and testing of superior reference genes for transcript normalization in Arabidopsis. Plant Physiology, 2005, vol. 139, no. 1, pp. 5–17. https://doi.org/10.1104/pp.105.063743

Echtay K.S., Roussel D., St-Pierre J., Jekabsons M.B., Cadenas S., Stuart J.A., Harper J.A., Roebuck S.J., Morrison A., Pickering S., Clapham J.C., Brand M.D. Superoxide activates mitochondrial uncoupling proteins. Nature, 2002, vol. 415, pp. 96-99. https://doi.org/10.1038/415096a

Elhafez D., Murcha M.W., Clifton R., Soole K.L., Day D.A., Whelan J. Characterization of mitochondrial alternative NAD(P)H dehydrogenases in Arabidopsis: intraorganelle location and expression. Plant Cell Physiology, 2006, vol. 47, no. 1, pp. 43-54. https://doi.org/10.1093/pcp/pci221

Fatihi A., Latimer S., Schmollinger S., Block A., Dussault P.H., Vermaas W.F.J., Merchant S.S., Basset G.J. A dedicated type II NADPH dehydrogenase performs the penultimate step in the biosynthesis of vitamin K1 in Synechocystis and Arabidopsis. Plant Cell, 2015, vol. 27, no. 6, pp. 1730-1741. https://doi.org/10.1105/tpc.15.00103

Finnegan P.M., Soole K.L., Umbach A.L. Alternative mitochondrial electron transport proteins in higher plants / Eds.: Day D.A., Millar H., Whelan J. Plant mitochondria: from genome to function. Kluwer Academic Publishers: Dordrecht, The Netherlands, 2004, pp. 163-230.

Michalecka A.M., Svensson A.S., Johansson F.I., Agius S.C., Johanson U., Brennicke A., Binder S., Rasmusson A.G. Arabidopsis genes encoding mitochondrial type II NAD(P)H dehydrogenases have different evolutionary origin and show distinct responses to light. Plant Physiol., 2003, vol. 133, no. 2, pp. 642-652. https://doi.org/10.1104/pp.103.024208

Millar A.H., Whelan J., Soole K.L., Day D.A. Organization and regulation of mitochondrial respiration in plants / Eds.: Merchant S.S., Briggs W.R., Ort D. Annual Review of Plant Biology, 2011, vol. 62, pp. 79-104. https://doi.org/10.1146/annurev-arplant-042110-103857

Polidoros A.N., Mylona P.V., Arnholdt-Schmitt B. Aox gene structure, transcript variation and expression in plants. Physiol. Plant., 2009, vol. 137, no. 4, pp. 342-353. https://doi.org/10.1111/j.1399-3054.2009.01284.x

Rasmusson A.G., Soole K.L., Elthon T.E. Alternative NAD(P)H dehydrogenases of plant mitochondria. Annu. Rev. Plant Biol., 2004, vol. 55, pp. 23-39. https://doi.org/10.1146/annurev.arplant.55.031903.141720

Rasmusson A.G., Moller I.M. Mitochondrial electron transport and plant stress. Plant Mitochondria; Ed.: Kempken F. NY: Springer, New York, 2011, pp. 357–381.

Reczek C.R., Chandel N.S. ROS-dependent signal transduction. Curr. Opin. Cell Biol., 2015, vol. 33, pp. 8-13. https://doi.org/10.1016/j.ceb.2014.09.010

Rikhvanov E.G., Gamburg K.Z., Varakina N.N., Rusaleva T.M., Fedoseeva I.V., Tauson E.L., Stupnikova I.V., Stepanov A.V., Borovskii G.B., Voinikov V.K. Nuclear-mitochondrial cross-talk during heat shock in Arabidopsis cell culture. Plant J., 2007, vol. 52, no. 4, pp. 763-778. https://doi.org/10.1111/j.1365-313X.2007.03275.x

Smith A.M., Ratcliffe R.G., Sweetlove L.J. Activation and function of mitochondrial uncoupling protein in plants. J. Biol. Chem., 2004, vol. 279, no. 50, pp. 51944-51952. https://doi.org/10.1074/jbc.M408920200

Smith C., Barthet M., Melino V., Smith P., Day D., Soole K. Alterations in the mitochondrial alternative NAD(P)H dehydrogenase NDB4 lead to changes in mitochondrial electron transport chain composition, plant growth and response to oxidative stress. Plant Cell Physiol., 2011, vol. 52, no. 7, pp. 1222-1237. https://doi.org/10.1093/pcp/pcr073

Sweetman C., Waterman C.D., Rainbird B.M., Smith P.M.C., Jenkins C.D., Day D.A., Soole K.L. AtNDB2 is the main external NADH dehydrogenase in mitochondria and is important for tolerance to environmental stress. Plant Physiology, 2019, vol. 181, no. 2, pp. 774-788. https://doi.org/10.1104/pp.19.00877

Vanlerberghe G.C. Alternative oxidase: a mitochondrial respiratory pathway to maintain metabolic and signaling homeostasis during abiotic and biotic stress in plants. Int. J. Mol. Sci., 2013, vol. 14, no. 4, pp. 6805-6847. https://doi.org/10.3390/ijms14046805

Wallström S.V., Florez-Sarasa I., Araújo W.L., Aidemark M., Fernán-dez-Fernández M., Fernie A.R, Ribas-Carbó M., Rasmusson A.G. Suppression of the external mitochondrial NADPH dehydrogenase, NDB1, in Arabidopsis thaliana affects central metabolism and vegetative growth. Mol. Plant., 2014a, vol. 7, no. 2, pp. 356-368. https://doi.org/10.1093/mp/sst115

Wallström S.V., Florez-Sarasa I., Araújo W.L., Escobar M.A., Geisler D.A., Aidemark M., Lager I., Fernie A.R., Ribas-Carbó M., Rasmusson A.G. Suppression of NDA-type alternative mitochondrial NAD(P)H dehydrogenases in Arabidopsis thaliana modifies growth and metabolism, but not high light stimulation of mitochondrial electron transport. Plant Cell Physiol., 2014, vol. 55, no. 5, pp. 881-896. https://doi.org/10.1093/pcp/pcu021


Просмотров аннотации: 143
Загрузок PDF: 76
Опубликован
2021-04-29
Как цитировать
Fedoseeva, I., Katyshev, A., Fedyaeva, A., Stepanov, A., & Borovskii, G. (2021). АНАЛИЗ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ В КЛЕТКАХ СУСПЕНЗИОННОЙ КУЛЬТУРЫ ARABIDOPSIS THALIANA С ПОНИЖЕННОЙ ЭКСПРЕССИЕЙ ГЕНА NDB2. Siberian Journal of Life Sciences and Agriculture, 13(2), 185-201. https://doi.org/10.12731/2658-6649-2021-13-2-185-201
Раздел
Биологические исследования