АНАЛИЗ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ В КЛЕТКАХ СУСПЕНЗИОННОЙ КУЛЬТУРЫ ARABIDOPSIS THALIANA С ПОНИЖЕННОЙ ЭКСПРЕССИЕЙ ГЕНА NDB2
Аннотация
Обоснование. Альтернативный путь дыхания митохондрий растений не связан с синтезом АТФ и, следовательно, не контролируется непосредственно энергетическим статусом клетки. Альтернативный дыхательный путь включает в себя ротенон нечувствительные NAD(Р)Н дегидрогеназы II типа, расположенные как на внешней, так и на внутренней поверхности внутренней мембраны митохондрий, убихинон и альтернативную оксидазу (AOX). Предполагается, что альтернативные NAD(P)H дегидрогеназы имеют функции, сходные с функциями AOX, среди которых термогенез, предотвращение образования АФК, окисление избытка восстановителей для продолжения метаболических путей и др. Публикаций об успешном подавлении экспрессии NDB2 пока недостаточно. Например, показано, что растения арабидопсиса, лишенные и AOX1a и NDB2 были более чувствительны к комбинированной засухе и повышенному освещению, в то время как растения, гиперэкспрессирующие эти гены, демонстрировали повышенную устойчивость и способность к постстрессовому восстановлению.
Цель. Целью данной работы являлось изучить, как подавление экспрессии NDB2 в гетеротрофных клетках суспензионной культуры арабидопсиса повлияет на экспрессию других генов альтернативного пути дыхания, разобщающих белков, а также генов белков теплового шока в не стрессовых условиях.
Материалы и методы. Для выделения РНК отбирали по 5 мл клеток суспензионных культур. РНК выделяли с помощью реактивов из набора GeneJET Plant RNA Purification Mini Kit (Thermo Scientific, Литва), согласно инструкции производителя.
Синтез первой цепи кДНК осуществляли с использованием набора реактивов Thermo Scientific (Литва), согласно рекомендациям фирмы производителя.
ПЦР-РВ проводили на приборе CFX96™ Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad, США), используя набор реактивов qPCR mix-HS SYBR (Евроген, Россия), согласно инструкции производителя. Анализ данных ПЦР-РВ проводили с помощью программного обеспечения SFX Manager (Bio-Rad, Германия). Все эксперименты проводились в двух аналитических и трех биологических повторностях. В качестве референсного гена использовали ген, кодирующий глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназу – GAPD.
Результаты. Количество мРНК гена NDB2 в клетках суспензионной культуры линии AS5 было снижено в 8,2 раза по сравнению с контролем Col-0. Подавление экспрессии гена NDB2 в клетках суспензионной культуры арабидопсиса линии AS5 приводило к увеличению количества транскриптов не только гена NDB4, но и NDB1, а также NDA2 и NDC1; в то же время экспрессия генов NDB3 и NDA1 снижалась по сравнению с клетками Col-0. Мы не обнаружили изменения уровней экспрессии генов AOX1a, AOX1b и AOX1d в клетках линии AS5 по сравнению с контролем, однако количество транскриптов гена AOX1c несколько увеличивалось. При анализе уровней экспрессии генов, кодирующих разобщающие белки, было обнаружено увеличение экспрессии гена UCP1 в клетках линии AS5. В клетках суспензионной культуры линии AS5 повышались уровни экспрессии всех исследуемых нами генов БТШ, кроме HSP17.7.
Заключение. Таким образом, полученные результаты предполагают, что подавление экспрессии гена NDB2 в гетеротрофных клетках арабидопсиса в отсутствие стресса изменяет редокс-статус клетки, что, в свою очередь, приводит к изменениям уровней накопления транскриптов других генов NAD(Р)Н дегидрогеназ и увеличению экспрессии генов БТШ, при этом экспрессия ключевых генов AOX не изменяется.
Скачивания
Литература
Rikhvanov E.G., Fedoseeva I.V., Pyatrikas D.V., Stepanov A.V., Borovskiy G.B., Voynikov V.K. Fiziologiya rasteniy, 2014, vol. 61, no. 2, pp. 155-169. https://doi.org/10.1134/S1021443714020125
Shishlova-Sokolovskaya A.M., Urbanovich O.Yu., Fedoseeva I.V., Bo-rovskiy G.B. Molekulyarnaya i prikladnaya genetika, 2017, vol. 22, pp. 76-83.
Amirsadeghi S., Robson C.A., Vanlerberghe G.C. The role of the mitochondrion in plant responses to biotic stress. Physiologia Plantarum, 2007, vol. 129, no. 1, pp. 253-266. https://doi.org/10.1111/j.1399-3054.2006.00775.x
Brand M.D. Mitochondrial generation of superoxide and hydrogen peroxide as the source of mitochondrial redox signaling. Free Radic. Biol. Med., 2016, vol. 100, pp. 14-31. https://doi.org/10.1016/j.freeradbiomed.2016.04.001
Clifton R., Millar A.H., Whelan J. Alternative oxidases in Arabidopsis: a comparative analysis of differential expression in the gene family provides new insights into function of non-phosphorylating bypasses. Biochimica et Biophysica Acta (BBA): Bioenergetics, 2006, vol. 1757, no. 7, pp. 730-741. https://doi.org/10.1016/j.bbabio.2006.03.009
Clough S.J., Bent A.F. Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. Plant J., 1998, vol. 16, no. 6, pp. 735-743. https://doi.org/10.1046/j.1365-313x.1998.00343.x
Considine M.J., Goodman M., Echtay K.S., Laloi M., Whelan J., Brand M.D., Sweetlove L.J. Superoxide stimulates a proton leak in potato mitochondria that is related to the activity of uncoupling protein. J. Biol. Chem., 2003, vol. 278, no. 25, pp. 22298-22302. https://doi.org/10.1074/jbc.M301075200
Czechowski T., Stitt M., Altmann T., Udvardi M.K., Scheible W.R. Genome-wide identification and testing of superior reference genes for transcript normalization in Arabidopsis. Plant Physiology, 2005, vol. 139, no. 1, pp. 5–17. https://doi.org/10.1104/pp.105.063743
Echtay K.S., Roussel D., St-Pierre J., Jekabsons M.B., Cadenas S., Stuart J.A., Harper J.A., Roebuck S.J., Morrison A., Pickering S., Clapham J.C., Brand M.D. Superoxide activates mitochondrial uncoupling proteins. Nature, 2002, vol. 415, pp. 96-99. https://doi.org/10.1038/415096a
Elhafez D., Murcha M.W., Clifton R., Soole K.L., Day D.A., Whelan J. Characterization of mitochondrial alternative NAD(P)H dehydrogenases in Arabidopsis: intraorganelle location and expression. Plant Cell Physiology, 2006, vol. 47, no. 1, pp. 43-54. https://doi.org/10.1093/pcp/pci221
Fatihi A., Latimer S., Schmollinger S., Block A., Dussault P.H., Vermaas W.F.J., Merchant S.S., Basset G.J. A dedicated type II NADPH dehydrogenase performs the penultimate step in the biosynthesis of vitamin K1 in Synechocystis and Arabidopsis. Plant Cell, 2015, vol. 27, no. 6, pp. 1730-1741. https://doi.org/10.1105/tpc.15.00103
Finnegan P.M., Soole K.L., Umbach A.L. Alternative mitochondrial electron transport proteins in higher plants / Eds.: Day D.A., Millar H., Whelan J. Plant mitochondria: from genome to function. Kluwer Academic Publishers: Dordrecht, The Netherlands, 2004, pp. 163-230.
Michalecka A.M., Svensson A.S., Johansson F.I., Agius S.C., Johanson U., Brennicke A., Binder S., Rasmusson A.G. Arabidopsis genes encoding mitochondrial type II NAD(P)H dehydrogenases have different evolutionary origin and show distinct responses to light. Plant Physiol., 2003, vol. 133, no. 2, pp. 642-652. https://doi.org/10.1104/pp.103.024208
Millar A.H., Whelan J., Soole K.L., Day D.A. Organization and regulation of mitochondrial respiration in plants / Eds.: Merchant S.S., Briggs W.R., Ort D. Annual Review of Plant Biology, 2011, vol. 62, pp. 79-104. https://doi.org/10.1146/annurev-arplant-042110-103857
Polidoros A.N., Mylona P.V., Arnholdt-Schmitt B. Aox gene structure, transcript variation and expression in plants. Physiol. Plant., 2009, vol. 137, no. 4, pp. 342-353. https://doi.org/10.1111/j.1399-3054.2009.01284.x
Rasmusson A.G., Soole K.L., Elthon T.E. Alternative NAD(P)H dehydrogenases of plant mitochondria. Annu. Rev. Plant Biol., 2004, vol. 55, pp. 23-39. https://doi.org/10.1146/annurev.arplant.55.031903.141720
Rasmusson A.G., Moller I.M. Mitochondrial electron transport and plant stress. Plant Mitochondria; Ed.: Kempken F. NY: Springer, New York, 2011, pp. 357–381.
Reczek C.R., Chandel N.S. ROS-dependent signal transduction. Curr. Opin. Cell Biol., 2015, vol. 33, pp. 8-13. https://doi.org/10.1016/j.ceb.2014.09.010
Rikhvanov E.G., Gamburg K.Z., Varakina N.N., Rusaleva T.M., Fedoseeva I.V., Tauson E.L., Stupnikova I.V., Stepanov A.V., Borovskii G.B., Voinikov V.K. Nuclear-mitochondrial cross-talk during heat shock in Arabidopsis cell culture. Plant J., 2007, vol. 52, no. 4, pp. 763-778. https://doi.org/10.1111/j.1365-313X.2007.03275.x
Smith A.M., Ratcliffe R.G., Sweetlove L.J. Activation and function of mitochondrial uncoupling protein in plants. J. Biol. Chem., 2004, vol. 279, no. 50, pp. 51944-51952. https://doi.org/10.1074/jbc.M408920200
Smith C., Barthet M., Melino V., Smith P., Day D., Soole K. Alterations in the mitochondrial alternative NAD(P)H dehydrogenase NDB4 lead to changes in mitochondrial electron transport chain composition, plant growth and response to oxidative stress. Plant Cell Physiol., 2011, vol. 52, no. 7, pp. 1222-1237. https://doi.org/10.1093/pcp/pcr073
Sweetman C., Waterman C.D., Rainbird B.M., Smith P.M.C., Jenkins C.D., Day D.A., Soole K.L. AtNDB2 is the main external NADH dehydrogenase in mitochondria and is important for tolerance to environmental stress. Plant Physiology, 2019, vol. 181, no. 2, pp. 774-788. https://doi.org/10.1104/pp.19.00877
Vanlerberghe G.C. Alternative oxidase: a mitochondrial respiratory pathway to maintain metabolic and signaling homeostasis during abiotic and biotic stress in plants. Int. J. Mol. Sci., 2013, vol. 14, no. 4, pp. 6805-6847. https://doi.org/10.3390/ijms14046805
Wallström S.V., Florez-Sarasa I., Araújo W.L., Aidemark M., Fernán-dez-Fernández M., Fernie A.R, Ribas-Carbó M., Rasmusson A.G. Suppression of the external mitochondrial NADPH dehydrogenase, NDB1, in Arabidopsis thaliana affects central metabolism and vegetative growth. Mol. Plant., 2014a, vol. 7, no. 2, pp. 356-368. https://doi.org/10.1093/mp/sst115
Wallström S.V., Florez-Sarasa I., Araújo W.L., Escobar M.A., Geisler D.A., Aidemark M., Lager I., Fernie A.R., Ribas-Carbó M., Rasmusson A.G. Suppression of NDA-type alternative mitochondrial NAD(P)H dehydrogenases in Arabidopsis thaliana modifies growth and metabolism, but not high light stimulation of mitochondrial electron transport. Plant Cell Physiol., 2014, vol. 55, no. 5, pp. 881-896. https://doi.org/10.1093/pcp/pcu021
Просмотров аннотации: 314 Загрузок PDF: 243
Copyright (c) 2021 Irina V. Fedoseeva, Alexander I. Katyshev, Anna V. Fedyaeva, Alexey V. Stepanov, Gennadii B. Borovskii
Это произведение доступно по лицензии Creative Commons «Attribution-NonCommercial-NoDerivatives» («Атрибуция — Некоммерческое использование — Без производных произведений») 4.0 Всемирная.
