ПРИМЕНЕНИЕ ПРОТОЧНОЙ ЦИТОМЕТРИИ ДЛЯ ОЦЕНКИ ЧИСЛЕННОСТИ И ФИЗИОЛОГИЧЕСКОГО СОСТОЯНИЯ ПРОКАРИОТ ТОРФА ВЕРХОВЫХ БОЛОТ
Аннотация
Обоснование. Торф верховых болот как субстрат характеризуется рядом специфических условий, усложняющих отделение микробных клеток для цитометрический обработки. При этом отсутствие актуальных протоколов пробоподготовки, подходящих для капиллярных цитометров, требует подбор оптимальных условий выделения и окрашивания клеток.
Цель. Изучить влияния условий предобработки при цитометрическом определении общей численности прокариот (ОЧП) и количества жизнеспособных прокариот (КЖП).
Материалы и методы. Для отделения бактериальных клеток от субстрата применялась физико-химическая обработка с ультразвуком (УЗ), с поверхностно активными веществами (ПАВ) и этанолом в различных вариациях для фиксированных и свежих проб. Выделенные клетки окрашивались флуорохромами: Акридин оранжевый, PI, DAPI, SYBR Green I. Для увеличения выхода клеток из субстрата проводилась ступенчатая промывка с центрифугированием и фильтрацией через 50 мкм фильтр. Для определения численности прокариот использовался капиллярный проточный цитометр Luminex Guava® EasyCyte 12HT. Контрольным методом анализа выступала люминесцентная микроскопия на чёрных мембранных фильтрах.
Результаты. Определена оптимальная концентрация и продолжительность окрашивания проб при использовании различных флуорохромов. Для акридина оранжевого – 20 мкг/мл 30 минут; PI и DAPI – 10 мкг/мл 60 минут; SYBR Green I – 1 x 60 минут. Установлена оптимальная продолжительность УЗ обработки, позволяющая выделить из субстрата максимальное количество клеток при сохранении их целостности, а именно для КЖП –15 мин и ОЧП – 30 мин. Дополнительная обработка пробы ПАВами позволяет существенно увеличить количество выделяемых из субстрата клеток. Проведении 3-х ступенчатой промывки субстрата позволяет увеличить количество выделяемых клеток с 50-60 % до 89-93 %.
Выводы. Адаптирована методика цитометрического определения общей численности (ОЧП) и количества жизнеспособных прокариот (КЖП) для слаборазложившегося торфа верховых болот. Установлено, что предпочтительным методом пробоподготовки при определении общей численности бактерий является физико-химическая обработка с ПАВами (30 мин УЗ, Triton X-100 (0,1 %), ПФ (0,1 %)). Подтверждена необходимость повышения времени УЗ обработки до 30 минут без значимой потери численности клеточной фракции и введения 3-х ступенчатой промывки.
Информация о спонсорстве. Исследование выполнено за счет средств Министерства высшего образования и науки Российской Федерации (проект № 122011400386-6)
EDN: DYTKGL
Скачивания
Литература
Список литературы
Асташкина А.П. Анализ микрофлоры воды и воздуха: методические указания к выполнению лабораторной работы по дисциплинам «Микробиология», «Фармакология, биохимия, микробиология» и «Биотехнология» // Томский политехнический университет. Томск: Изд-во Томского политехнического университета, 2015, 25 с.
Постовалов, А. А. Выявление факторов, определяющих микробиологическую активность биоценоза / А. А. Постовалов, С. Ф. Суханова, Ю. А. Курская // Siberian Journal of Life Sciences and Agriculture. 2022. Т. 14, № 1. С. 286-302. https://10.12731/2658-6649-2022-14-1-286-302
Buesing N., Gessner M.O. 2002. Comparison of detachment procedures for direct counts of bacteria associated with sediment particles plant litter and epiphytic biofilm // Aquat. Microb. Ecol, 2002, vol. 27, pp. 29–36. https://doi.org/10.3354/ame027029
Bogdanova O.Y., Golovchenko A.V., Lysak L.V., Glukhova T.V., Zvyagintsev D.G. Viability of bacteria in peatlands // Eurasian soil science, 2014, vol. 47, pp. 297-303. https://doi.org/10.1134/S1064229314020033
Button D. K., Robertson B. R. Determination of DNA content of aquatic bacteria by flow cytometry // Applied and Environmental Microbiology, 2001, vol. 67, no. 4, pp. 1636-1645. https://doi.org/10.1128/AEM.67.4.1636-1645.2001
Dobrovol’skaya T.G., Golovchenko A.V., Kukharenko O.S., Yakushev A.V., Semenova T.A., Inisheva L.A. The structure of the microbial communities in low-moor and high-moor peat bogs of Tomsk oblast // Eurasian Soil Sc, 2012, vol. 45, pp. 273–281. https://doi.org/10.1134/S1064229312030039
Danovaro R., Middelboe M. Separation of free virus particles from sediments in aquatic systems // Manual of Aquatic Viral Ecology. ASLO, 2010, vol. 14, pp. 74-81. https://doi.org/10.4319/mave.2010.978-0-9845591-0-7.74
Davey H. M., Hexley P. Red but not dead? Membranes of stressed Saccharomyces cerevisiae are permeable to propidium iodide // Environmental microbiology, 2011, vol. 13. no. 1, pp. 163-171. https://doi.org/10.1111/j.1462-2920.2010.02317.x
Frossard A., Hammes F., Gessner M. O. Flow cytometric assessment of bacterial abundance in soils, sediments and sludge // Frontiers in microbiology, 2016, vol. 7, 903 p. https://doi.org/10.3389/fmicb.2016.00903
Francisco D. E., Mah R. A., Rabin A. C. Acridine orange-epifluorescence technique for counting bacteria in natural waters // Transactions of the American Microscopical Society, 1973, pp. 416-421. https://doi.org/10.2307/3225245
Golovchenko A.V., Sannikova Y.V., Dobrovol’skaya T.G., Zvyagintsev D.G. The saprotrophic bacterial complex in the raised peat bogs of western Siberia // Microbiology, 2005, vol. 74, pp. 471-476. https://doi.org/10.1007/s11021-005-0091-y
Guava easyCyteTM System User Guide For systems running guavaSoftTM software version 3.1, 0110-8493 Rev B, 2014.
Kukharenko O.S., Dobrovol’skaya T.G., Golovchenko A.V., Stepanov A.L., Matyshak G.V. The structure of the bacterial heterotrophic block in tundra soils of Yamal Peninsula //Eurasian Soil Science, 2009, vol. 42, pp. 426-431. https://doi.org/10.1134/S1064229309040097
Kallmeyer J., Smith D. C., Spivack A. J., D'Hondt S. New cell extraction procedure applied to deep subsurface sediments // Limnology and Oceanography: Methods, 2008, vol. 6, no. 6, pp. 236-245. https://doi.org/10.4319/lom.2008.6.236
Khalili B., Weihe C., Kimball S., Schmidt K.T., Martiny J.B. Optimization of a method to quantify soil bacterial abundance by flow cytometry // MSphere, 2019, vol. 4, no. 5, pp. 10-19. https://doi.org/10.1128/mSphere.00435-19
Lew S., Glińska-Lewczuk K., Lew M. The effects of environmental parameters on the microbial activity in peat-bog lakes // PLoS One, 2019, vol. 14, no. 10. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0224441
Lysak L.V., Lapygina E.V., Kadulin M.S., Konova I.A. Number, viability, and diversity of the filterable forms of prokaryotes in sphagnous high-moor peat // Biology Bulletin, 2014, vol. 41, pp. 228-232. https://doi.org/10.1134/S1062359014030066
Lunau M., Lemke A., Walther K., Martens‐Habbena W., Simon M. An improved method for counting bacteria from sediments and turbid environments by epifluorescence microscopy // Environmental Microbiology, 2005, vol. 7, no. 7, pp. 961-968. https://doi.org/10.1111/j.1462-2920.2005.00767.x
Haynes M., Seegers B., Saluk A. Advanced analysis of marine plankton using flow cytometry // Biotechniques, 2016, vol. 60, no. 5, pp. 260. https://doi.org/10.2144/000114418
El Mujtar V.A., Chirdo F., Lagares A., Wall L., Tittonell P. Soil bacterial biodiversity characterization by flow cytometry: The bottleneck of cell extraction from soil // Methods in Ecology and Evolution, 2022, vol. 13, no. 7, pp. 1388-1401. https://doi.org/10.1111/2041-210X.13876
McKinnon K. M. Flow cytometry: an overview // Current protocols in immunology. 2018, vol. 120, no. 1, pp. 11-21. https://doi.org/10.1002/cpim.40
Parks D. R., Roederer M., Moore W. A. A new “Logicle” display method avoids deceptive effects of logarithmic scaling for low signals and compensated data // Cytometry Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology, 2006, vol. 69, no. 6, pp. 541-551. https://doi.org/10.1002/cyto.a.20258
Page S., Burns R.G. Flow cytometry as a means of enumerating bacteria introduced into soil // Soil Biology and Biochemistry, 1991, vol. 23, no. 11, pp. 1025–1028. https://doi.org/10.1016/0038-0717(91)90038-L
Robinson J. P. Overview of flow cytometry and microbiology // Current protocols in cytometry, 2018, vol. 84, no. 1, pp. 108-131. https://doi.org/10.1002/cpcy.37
Rylkova O. A., Gulin S. B., Pimenov N. V. Determination of the total microbial abundance in black sea bottom sediments using flow cytometry // Microbiology, 2019, vol. 88, pp. 700-708. https://doi.org/10.1134/S0026261719060158
Wilkinson M. G. Flow Cytometry in Microbiology // Ireland: Wilkinson Department of Life Sciences, University of Limerick, 2015, 230 p.
Zvyagintsev D. G. Methods of soil microbiology and biochemistry. Moscow: MSU, 1991, 304 p.
Zubov I.N., Orlov A.S., Selyanina S.B., Zabelina S.A., Ponomareva T.I. Redox potential and acidity of peat are key diagnostic physicochemical properties for the stratigraphic zones of a boreal raised bog // Mires & Peat, 2022, no. 28. https://doi.org/10.19189/MaP.2020.GDC.StA.1987
References
Astashkina A.P. Analiz mikroflory vody i vozdukha: metodicheskie ukazaniya k vypolneniyu laboratornoy raboty po distsiplinam «Mikrobiologiya», «Farmakologiya, biokhimiya, mikrobiologiya» i «Biotekhnologiya» [Analysis of the microflora of water and air: methodological guidelines for laboratory work in the disciplines of "Microbiology", "Pharmacology, biochemistry, microbiology" and "Biotechnology"]. Tomsk: TPU Publ., 2015, 25 p.
Postovalov A.A., Sukhanova S.F., Kurskaya Y.A. Vyyavlenie faktorov, opredelyayushchikh mikrobiologicheskuyu aktivnost' biotsenoza [Identification of factors determining the microbiological activity of the biocenosis]. Siberian Journal of Life Sciences and Agriculture, 2022, vol. 14, no. 1, pp. 286-302. https://10.12731/2658-6649-2022-14-1-286-302
Buesing N., Gessner M.O. 2002. Comparison of detachment procedures for direct counts of bacteria associated with sediment particles plant litter and epiphytic biofilm. Aquat. Microb. Ecol, 2002, vol. 27, pp. 29–36. https://doi.org/10.3354/ame027029
Bogdanova O.Y., Golovchenko A.V., Lysak L.V., Glukhova T.V., Zvyagintsev D.G. Viability of bacteria in peatlands. Eurasian soil science, 2014, vol. 47, pp. 297-303. https://doi.org/10.1134/S1064229314020033
Button D. K., Robertson B. R. Determination of DNA content of aquatic bacteria by flow cytometry. Applied and Environmental Microbiology, 2001, vol. 67, no. 4, pp. 1636-1645. https://doi.org/10.1128/AEM.67.4.1636-1645.2001
Dobrovol’skaya T.G., Golovchenko A.V., Kukharenko O.S., Yakushev A.V., Semenova T.A., Inisheva L.A. The structure of the microbial communities in low-moor and high-moor peat bogs of Tomsk oblast. Eurasian Soil Sc, 2012, vol. 45, pp. 273–281. https://doi.org/10.1134/S1064229312030039
Danovaro R., Middelboe M. Separation of free virus particles from sediments in aquatic systems. Manual of Aquatic Viral Ecology, 2010, vol. 14, pp. 74-81. https://doi.org/10.4319/mave.2010.978-0-9845591-0-7.74
Davey H. M., Hexley P. Red but not dead? Membranes of stressed Saccharomyces cerevisiae are permeable to propidium iodide. Environmental microbiology, 2011, vol. 13, no. 1, pp. 163-171. https://doi.org/10.1111/j.1462-2920.2010.02317.x
Frossard A., Hammes F., Gessner M. O. Flow cytometric assessment of bacterial abundance in soils, sediments and sludge. Frontiers in microbiology, 2016, vol. 7, 903 p. https://doi.org/10.3389/fmicb.2016.00903
Francisco D. E., Mah R. A., Rabin A. C. Acridine orange-epifluorescence technique for counting bacteria in natural waters. Transactions of the American Microscopical Society, 1973, pp. 416-421. https://doi.org/10.2307/3225245
Golovchenko A.V., Sannikova Y.V., Dobrovol’skaya T.G., Zvyagintsev D.G. The saprotrophic bacterial complex in the raised peat bogs of western Siberia. Microbiology, 2005, vol. 74, pp. 471-476. https://doi.org/10.1007/s11021-005-0091-y
Guava easyCyteTM System User Guide For systems running guavaSoftTM software version 3.1, 0110-8493 Rev B, 2014.
Kukharenko O.S., Dobrovol’skaya T.G., Golovchenko A.V., Stepanov A.L., Matyshak G.V. The structure of the bacterial heterotrophic block in tundra soils of Yamal Peninsula. Eurasian Soil Science, 2009, vol. 42, pp. 426-431. https://doi.org/10.1134/S1064229309040097
Kallmeyer J., Smith D. C., Spivack A. J., D'Hondt S. New cell extraction procedure applied to deep subsurface sediments. Limnology and Oceanography: Methods, 2008, vol. 6, no. 6, pp. 236-245. https://doi.org/10.4319/lom.2008.6.236
Khalili B., Weihe C., Kimball S., Schmidt K.T., Martiny J.B. Optimization of a method to quantify soil bacterial abundance by flow cytometry. MSphere, 2019, vol. 4, no. 5, pp. 10-19. https://doi.org/10.1128/mSphere.00435-19
Lew S., Glińska-Lewczuk K., Lew M. The effects of environmental parameters on the microbial activity in peat-bog lakes. PLoS One, 2019, vol. 14, no. 10. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0224441
Lysak L.V., Lapygina E.V., Kadulin M.S., Konova I.A. Number, viability, and diversity of the filterable forms of prokaryotes in sphagnous high-moor peat. Biology Bulletin, 2014, vol. 41, pp. 228-232. https://doi.org/10.1134/S1062359014030066
Lunau M., Lemke A., Walther K., Martens‐Habbena W., Simon M. An improved method for counting bacteria from sediments and turbid environments by epifluorescence microscopy. Environmental Microbiology, 2005, vol. 7, no. 7, pp. 961-968. https://doi.org/10.1111/j.1462-2920.2005.00767.x
Haynes M., Seegers B., Saluk A. Advanced analysis of marine plankton using flow cytometry. Biotechniques, 2016, vol. 60, no. 5, pp. 260. https://doi.org/10.2144/000114418
El Mujtar V.A., Chirdo F., Lagares A., Wall L., Tittonell P. Soil bacterial biodiversity characterization by flow cytometry: The bottleneck of cell extraction from soil. Methods in Ecology and Evolution, 2022, vol. 13, no. 7, pp. 1388-1401. https://doi.org/10.1111/2041-210X.13876
McKinnon K. M. Flow cytometry: an overview. Current protocols in immunology. 2018, vol. 120, no. 1, pp. 11-21. https://doi.org/10.1002/cpim.40
Parks D. R., Roederer M., Moore W. A. A new “Logicle” display method avoids deceptive effects of logarithmic scaling for low signals and compensated data. Cytometry Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology, 2006, vol. 69, no. 6, pp. 541-551. https://doi.org/10.1002/cyto.a.20258
Page S., Burns R.G. Flow cytometry as a means of enumerating bacteria introduced into soil. Soil Biology and Biochemistry, 1991, vol. 23, no. 11, pp. 1025–1028. https://doi.org/10.1016/0038-0717(91)90038-L
Robinson J. P. Overview of flow cytometry and microbiology. Current protocols in cytometry, 2018, vol. 84, no. 1, pp. 108-131. https://doi.org/10.1002/cpcy.37
Rylkova O. A., Gulin S. B., Pimenov N. V. Determination of the total microbial abundance in black sea bottom sediments using flow cytometry. Microbiology, 2019, vol. 88, pp. 700-708. https://doi.org/10.1134/S0026261719060158
Wilkinson M. G. Flow Cytometry in Microbiology. Ireland: Wilkinson Department of Life Sciences. University of Limerick, 2015, 230 p.
Zvyagintsev D. G. Methods of soil microbiology and biochemistry. Moscow: MSU, 1991, 304 p.
Zubov I.N., Orlov A.S., Selyanina S.B., Zabelina S.A., Ponomareva T.I. Redox potential and acidity of peat are key diagnostic physicochemical properties for the stratigraphic zones of a boreal raised bog. Mires & Peat, 2022, no. 28. https://doi.org/10.19189/MaP.2020.GDC.StA.1987
Просмотров аннотации: 22 Загрузок PDF: 12
Copyright (c) 2024 Dmitriy A. Shpanov, Ivan N. Zubov
Это произведение доступно по лицензии Creative Commons «Attribution-NonCommercial-NoDerivatives» («Атрибуция — Некоммерческое использование — Без производных произведений») 4.0 Всемирная.
